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Science:无需完全配对 谈医论药
作者:筱玥 来源:yaozh 时间:2014-11-14 ? 评论: 0 ? 阅读: 966 A+ A-
导读

microRNA-mRNA–human Argonaute的结构详细揭示了分子间的相互作用是在何处、以及如何发生的。

 microRNA-mRNA–human Argonaute的结构详细揭示了分子间的相互作用是在何处、以及如何发生的。

 

    在真核细胞内,小的非编码RNA通过靶向mRNA来阻止蛋白质的翻译进程,从而沉默基因表达。这些miRNA可以招募一种叫做RNA诱导性沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物,并引导其靶向mRNA,造成miRNA-mRNA退火,从而令RISC发挥翻译抑制作用(图:二元及三元复合物,A)。Argonaute(Ago)蛋白是RISC的关键组成部分,它在原核细胞和真核细胞中都是高度保守的,并在基因沉默中发挥着不可缺少的作用。人们对Ago蛋白沉默基因机制的了解,最初始于对原核细胞内由Ago蛋白参与形成的二元复合物和三元复合物的X射线晶体学的研究。在原核细胞内,Ago蛋白与引导链(DNA)结合在一起,形成二元复合物;如果这个二元复合物再与靶向链(RNA或DNA)结合在一起,则形成三元复合物。这些分子结构学的研究主要集中在siRNA介导的靶向mRNA的剪切,而最近对于真核细胞内同类复合物的研究则集中于miRNA介导的翻译抑制作用。本文则主要介绍Schirle等人在由人类Argonaute2(hAgo2)参与形成的二元复合物和三元复合物结构方面的研究。


    Ago蛋白采取双叶支架的折叠形式,由N端(N和PAZ结构域)及C端(MID和PIWI结构域)两叶组成。PIWI结构域为RNase H折叠,它包括参与siRNA介导的靶向剪切的催化性酸性残基。对嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Ago(TtAgo)二元复合物与引导链(此处指DNA)结合的结构学研究则发现了位于两叶之间的核酸结合通道,其中,引导链已磷酸化的5’端位于Ago的MID结构域内,3’端则位于PAZ结构域。值得注意的是,引导链上2至6位的核苷酸呈现出螺旋状排布,其碱基指向螺旋外侧,以便与靶向RNA配对。因此,这一螺旋结构组成了靶向识别的成核步骤。


    后续的结构学研究则对TtAgo与DNA引导链及靶向RNA(或DNA)结合在一起所组成的三元复合物进行了研究。这些研究明确了与催化循环中成核、扩展、剪切步骤相关的枢纽样构象改变。在这些结构学研究中,研究人员使用不同长度的,与引导链种子片段(第2至8位核苷酸)、靶向剪切位点(第10和11位核苷酸)、以及增补片段(第12至19位核苷酸)互补的靶向链。研究还确定了一对Mg2+及位于Ago蛋白PIWI结构域内的酸性残基在介导化学物质剪切方面的作用。从功能学的角度看,DNA和RNA引导的原核细胞内的Ago都会参与防御可移动遗传元件(mobile genetic elements)的过程。


    siRNA介导的靶向mRNA剪切需要引导链和靶向链精确互补配对,但与此不同,miRNA只需要引导链和靶向链在配对时横跨靶向mRNA的种子片段(核苷酸2至8位),从而抑制翻译、导致降解。Dicer和Ago这两种酶类物质参与介导miRNA的生成,并将前体miRNA转化成为成熟的miRNA,随后成熟miRNA被装载于Ago上。为了搞清楚miRNA介导的翻译抑制原理,研究者将针对原核生物Ago(pAgo)复合体的结构学研究,扩展到了真核细胞内Ago(eAgo)的领域。这包括对hAgo2的二元复合物的研究以及与gRNA链结合的芽殖酵母Kluyveromyces polysporus Ago(KpAgo)的研究。gRNA链的种子片段——混合序列或者确定的序列——结合于eAgo复合物的两端,2号至5号核苷酸指向外侧,可与靶向RNA配对,这一点与原核细胞内情况一致。此外,对与gRNA结合的KpAgo二元复合物的研究发现了一个关键的谷氨酸,它与剪切元件的构象的形成相关。这个氨基酸插入eAgo的“催化袋”内,从而形成完整的催化四合物(含有四个酸性残基)。


    若要将这些研究扩展到三元复合物上,需要Schirle等人获得并纯化得到毫克级的、结合于gRNA某个确定序列的hAgo2,这样才能有足够的物质以制备结晶三元复合物以及进行结构测定。结构分析借助两个复合物的X射线数据集(分辨率均为2.9 ?)来完成,包括携带5’端磷酸化的gRNA(长度为21个核苷酸)的hAgo2二元复合物的X射线数据集(图:二元及三元复合物,B),以及额外携带靶向RNA(长度为11个核苷酸)的三元复合物的X射线数据集。在这个三元复合物中,靶向RNA与gRNA(分辨率为1.8 to 2.5 ?)的2至7、2至8或2至9号核苷酸片段互补(图:二元及三元复合物,C)。


    Schirle等人的研究结果表明,有hAgo2参与的三元复合物形成的过程中,引导链-靶向链双链结构中的小沟形状互补,促进了复合体的形成,互补段跨越种子片段2至7位核苷酸,此外,相互作用的Ago折叠中的疏水性残基也有助于该复合体的形成。这解释了为何种子片段区域的引导链-靶向链的错配会导致严重后果。与之相反,如果错配发生在8和9位核苷酸,则无伤大雅。早期针对二元eAgo复合体的结构学研究,发现了在引导链第6和7号核苷酸之间存在一个扭结,这是源于来自蛋白质螺旋α7的异亮氨酸残基的插入。令人吃惊的是,Schirle等人发现,一旦三元复合物形成,6和7号核苷酸就会形成堆叠螺旋的构象,α7结构则有一个4 ?的移动。这一改动才能使得引导链-靶向链双链结构得以存在于hAgo2折叠内。

 

    hAgo2双元复合物与确定序列gRNA相结合的另一个引人注意的发现是,跨越14至18号核苷酸的引导链首次被检测到,此外,与预想一致,该复合体与引导链的两端都结合,以及种子片段采取螺旋排列形式。14至18号核苷酸这一段序列,结合在N和PAZ结构域之间的一个狭窄通道内,由于其碱基指向内侧,因此无法进行碱基配对。与之相对,一旦和靶向RNA一起形成三元复合物时,14至18位核苷酸片段就会出现巨大的构象改变,从原本的松散状转变为堆叠在一起,其碱基指向外侧,以便进行碱基配对。


    当hAgo2二元复合物变为三元复合物时,在引导链内所出现的显著的构象改变,促使Schirle等人对miRNA靶向机制提出了一个逐步进行的模型,miRNA引导链首先对mRNA进行判断,通过种子2至5位核苷酸配对,鉴别出候选靶向位点。这一步触发了hAgo2构象的改变,包括α7和PAZ结构域,种子片段6至8位核苷酸,以及增补片段13至16位核苷酸组成的螺旋结构中,碱基指向外侧,以便进行额外的靶向识别。在这个模型中,9至12位核苷酸不参与碱基配对,说明这一片段内的退火对翻译抑制不起重要作用。因此,Ago2蛋白中跨越2至8号及13至16号核苷酸的引导链-靶向链识别,避免了与核苷酸-结合通道内完全配对相关的拓扑学约束。


    今后的工作中,将对更长的靶向RNA进行研究,从而进一步观察在miRNA介导的hAgo2三元复合体内的引导链-靶向链配对情况,不仅仅局限于2至8位核苷酸,还包括13至16位核苷酸的片段。此外,siRNA介导的剪切过程,需要靶向mRNA与hAgo2(hAgo1、hAgo3及hAgo4则不需要)精确配对的原因还未可知。这样的剪切由PIWI结构域内的RNase H折叠参与,需要引导链和靶向链10和11号位的核苷酸的碱基配对,以及一对Mg2+和催化性四合体——由组氨酸及三个酸性残基组成——在hAgo2剪切位点的精确定位。不过,我们还需进行更多的结构研究,以便阐明hAgo2的N结构域在siRNA介导的mRNA剪接中的作用。

 

原文检索:

Dinshaw J. Patel. Complete pairing not needed. Science, 31 October 2014: DOI: 10.1126/science.1262123

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